Kallis Microbe

Share Tweet Pin it

Kuna Pasteur on teada, on inimese seedetrakt sisuliselt voolu tüüpi bioreaktor, milles elavad paljud mikroorganismid. Selle aja jooksul on teadlaste suhtumine soole mikrofloorasse radikaalselt muutunud. Sada aastat tagasi oli Ilya Mechnikov, kaasaegse immuunsuse teooria asutaja, mille loomiseks ta sai Nobeli auhinna (kaks tema kaudselt vastasega, vähemalt sama suur Paul Ehrlich) pakkus isegi välja jämesoole eemaldamiseks üheks elundi pikendamise viisiks. Ja neile, kellele see meede tundus olevat liiga radikaalne, soovitasin ma nii palju keefiini kui võimalik, et suruda kahjulikke, tema arvates mikroobid kasulike piimhappebakteritega. Poolteist sajandit on kursus muutunud 180 kraadi võrra. Selgus, et normaalne soole mikrofloor, samuti nahk ja limaskestad, täidavad paljusid kasulikke funktsioone - näiteks pärsib kehas pidevalt ründavate patogeensete mikroorganismide elutähtsat toimet. Ja viimastel aastatel on mikrobioloogide kõige julgemad inimesed läinud veelgi kaugemale, kuulutades inimese ja tema mikroobide kui ühe sümbiootilise superorganismi.

Molekulaarbioloogia meetodite väljatöötamine tõi teadlased uuele tasemele inimese ja tema mikrofloora sümbioosi protsesside mõistmise, mis tundus olevat hästi uuritud ja mille uurimisest ei oodata mingeid erilisi üllatusi. Kiiruse kiire kasv ja DNA sekveneerimismeetodite (selle nukleotiidijärjestuse määramine) kulude langus ning personaalarvutite võimsuse paralleelne kasv ja Interneti arendamine võimaldasid analüüsida genoomi suurte piirkondade teavet. Pärast seda, kui sadu üksikute bakteriliikide kromosoome on detekteeritud, on mikroorganismide geneetikas muutunud uus lähenemisviis - populatsiooniline lähenemine: kõigi bakterite geenide analüüsimine, mis asuvad konkreetses piirkonnas korraga. Loomulikult osutus "inimese bioreaktori" populatsioon mikroobide populatsiooni uurimiseks kõige olulisemaks.

Esimene töö, mille tulemuseks oli uus nägemus soolestiku mikrobioolist, avaldati 1999. aastal riikliku Agronomisuuringute Instituudi (Prantsusmaa) ja Readingi Ülikooli (Ühendkuningriik) teadlaste rühmaga. Autorid otsustavad rakendada 16S RNA geenide sekveneerimise meetodit soole mikroobide populatsiooni uurimiseks.

16S RNA - bakterite ID

Kuna Pasteur on esimene ja vajalik samm mikroorganismide kindlaksmääramisel, on nende kasvatamine toitainete keskkonnas. Kuid paljud olulised (ja kasulikud ja patogeensed) mikroobid ei soovi kasvada ükskõik millises keskkonnas. Uuring varem ligipääsmatud uncultivable bakterite ja hakkab koristada sootuks segane taksonoomia tuntud prokarüoodid sai võimalikuks arengut bioinformaatikat ja tulek kaasaegse molekulaarbioloogia meetoditega - polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), mis võimaldab ühes tükis DNA saamiseks miljoneid ja miljardeid täpsed koopiad, kloon isoleeritud kasutades PCR-geene bakteriaalsetel plasmiididel ja sekveneerimismeetodeid nukleotiidjärjestuste jaoks, mis on saadud selle tulemusena, mis on piisav ana Iza summa.

Ideaalne marker mikroorganismide identifitseerimiseks oli 16S ribosoomi RNA-d kodeeriv geen (ribosoomi igaüks kahest allüksusest - valkude sünteesi raku töötoad - koosnevad põimitud proteiini molekulidest ja ribonukleiinhapete ahelatest).

See geen on kõigi tuntud bakterite ja arheede genoomis, kuid eukarüootides ja viirustes puuduvad ja kui olete leidnud selle iseloomuliku nukleotiidjärjestuse, tegelete kindlasti prokarüootide geenidega. (Täpselt on 16S RNA geen olemas ka eukarüootides, kuid mitte tuumikromosoomides, vaid mitokondrite kromosoomides. See kinnitab veelkord, et mitokondrid on esimeste eukarüootsete organismide sümbiont-bakterite kaugemad järeltulijad.)

Sellel geenil on nii konservatiivsed piirkonnad kui ka kõigi prokarüootide puhul ja liikide suhtes spetsiifilised. Konservatiivsed saidid serveerivad polümeraasi ahelreaktsiooni esimest etappi - katse DNA kinnitamine praimeritele (DNA seemnepiirkonnad, millega uuritud nukleotiidide ahel peab liituma, et alustada ülejäänud järjestuse analüüsimist) ja liigispetsiifilised - liikide määramiseks. Lisaks sellele peegeldab liigispetsiifiliste kruntide sarnasuse aste väga hästi erinevate liikide evolutsioonilist sugulust.

Täiendav boonus on kloonimise ja järgneva analüüsi jaoks, saate kasutada ribosomaalset RNA-d, mis esineb mis tahes rakus palju suuremas koguses kui selle vastav geen. Ainult teie peate esmalt "redigeerima" seda DNAs, kasutades selleks spetsiaalset ensüümi - pöördtranskriptaasi.

Laialdaselt on saadaval kõigi tuntud bakterite ja arheede (umbes 10 000 liigi) 16S RNA nukleotiidijärjestused. Identifitseeritud järjestusi võrreldakse andmebaaside omadustega ja täpselt tuvastavad bakteritüübid või deklareerivad, et need kuuluvad järgmisesse haritamata liikidesse.

Hiljuti on intensiivselt läbi vaadatud vanad, fenotüübilised, bakterite klassifikatsioonid, mis põhinevad halvasti vormistatud kriteeriumidel - alates kolooniate välimusest toiduseelistustele ja võime värvida erinevate värvainetega. Uus süstemaatika põhineb molekulaarkriteeriumidel (16S RNA) ja ainult osaliselt kordab fenotüübilist.

Koodeerimisjärjestused 16S RNA PCR koguti otse "keskkond" - 125 milligrammi inimese, kahju, väljaheites, sisestati plasmiidi E. coli (mitte sellepärast, et soolestiku ja kuna Escherichia coli - üks atraktiivsemaid workhorse molekulaarbiolooge ) ja jälle isoleeritud paljundatud bakterite kultuurist. Seega moodustati kõigi proovi mikroorganismide 16S RNA geenide raamatukogu. Seejärel juhuslikult valiti ja sekveneeriti 284 klooni. Selgus, et ainult 24% saadud 16S RNA järjestustest kuulus varem tuntud mikroorganismidele. Rohkem kui sada aastat välistanud iga neljakümne viie mikrofloora iga inimese soolte eest klassikalise mikrobioloogiaga varustatud teadlaste tähelepanu! Teadlased lihtsalt ei suutnud leida tingimusi nende bakterite kasvatamiseks, sest kõige nördimatud soolestiku elanikud keeldusid traditsioonilisest mikrobioloogilisest keskkonnast kasvatama.

Täna, kasutades molekulaarseid meetodeid, on kindlaks tehtud, et kümnest 70 suurema bakteriaalse taksonist on täiskasvanu mikrobiotis esindatud. Umbes 90% meie mikroobidest kuuluvad Firmicute tüüpi (näiteks tuntud laktobakterid on piima souring peamised "süüdlased") ja Bacteroidetes on kohustuslikud anaeroobid (organismid, mis võivad elada üksnes hapniku puudumisel), mida sageli kasutatakse reostuse indikaatorina looduslikud veed kanalisatsioon. Ülejäänud 10% elanikkonnast jagunes taksonit Proteobacterite (need hõlmavad muu hulgas, E. coli), Aktinomütseedid (ühest liigist Actinomycetes antibiootikumi streptomütsiini eraldati), Fusobacteria (normaalsed elanikud suuõõne- ja põhjustavad sageli parodontiit), Verrucomicrobia (hiljuti leiti, et geotermiline allikas on selliste mikroobide liigid, mis toidavad metaani, mis on teiste mikroorganismide elulise aktiivsuse tõttu soolestikus), tsüaanobakterid (neid nimetatakse endiselt sageli vanaks nimetuseks "sinivetikad"), spiroheaedid ( tew, mitte kahvatu), Synergistes ja VadinBE97 (millised loomad on need, küsi loojatelt uuest prokarüootsest süsteemist).

Hoolimata asjaolust, et soole mikroorganismide liigiline koosseis on üsna monotoonne, võib erinevate inimeste erinevate mikroobiootiliste süstemaatiliste rühmade esindajate kvantitatiivne suhe olla väga erinev. Kuid mis on normaalne soole mikrofloor ja millised on selle moodustamise viisid?

Sellele küsimusele vastasid Stanfordi ülikooli Patrick Browni juhitud Ameerika bioloogide rühma 2007. aasta töö. Nad jälgisid mikroobioti moodustumist 14 vastsündinud beebil esimesel eluaastal. Autorid suutsid luua mitmeid seedetrakti koloniseerimise allikaid. Imiku mikrobiootil oli sarnane ema mikroflooraga: rinnapiima proovide vaginaalne, väljaheide või mikrofloora. Sõltuvalt koloniseerumisallikatest esines esimese eluaasta jooksul imikute soole mikroflooras eri liike. Need erinevused olid kogu uurimisperioodi jooksul olulised, kuid üheaastase vanuse järgi sai täheldatud täiskasvanud mikrobiota moodustumine. Huvitavad andmed saadi kaksikutega. Nendes sisalduv mikrofloor oli kompositsioonist peaaegu identne ja sama ka sama. See avastus näitas mikrobiota-peremehepaari inimese komponendi tohutut rolli soolestiku mikrofloora populatsiooni moodustamisel. Katse puhtuse jaoks on loomulikult vaja eraldada lapsed veel haiglas - see on suurepärane lugu India filmi jaoks! Aastate jooksul saavad nad üksteisest analüüsi kaudu teada... Kuid teiste tööde andmed kinnitasid eeldust, et inimese biokeemilisest indiviidist, sealhulgas pärilikest omadustest, on suur mõju mikroobioosi koostisele.

Mikroobide meis on rohkem kui inimene

Lisaks teatud tüüpi soole mikrofloora uurimisele on viimastel aastatel uuritud bakteriaalset meta-geeni - kõigi mikroorganismide geenide komplekti inimese soole sisu proovis (kas pestakse nahalt või merepõhja proovist niiskust). Selleks kõige automatiseeritud, elektrooniliseks ja kõrgjõudlusega DNA sekveneerimise tehnoloogiad, mis võimaldavad analüüsida lühikese nukleotiidijärjestused, koguda puzzle mitut kokkulangevad "tähed" otstes esimesest osast, multiple korrake protseduuri iga tükk genoomi ja vastuvõtmiseks dekodeerimine üksikute geenide ja kromosoomide kiirusega kuni 14 miljonit nukleotiidi tunnis - suurusjärgus kiiremini kui seda tehti vaid paar aastat tagasi. Nii leiti, et inimese soolestiku mikrobioos on umbes 100 triljoni bakteriraku - umbes 10 korda suurem kui peremeesorganismi rakkude koguarv. Bakteriaalse metagenoomi moodustavate geenide komplekt on ligikaudu 100 korda suurem kui inimese keha geenide komplekt. Kui me räägime mikroobide populatsioonis toimuvate biokeemiliste reaktsioonide mahust, on see jälle palju kordi kõrgem kui inimese kehas. Bakteriaalne "reaktor" rakendab peremeesorganismi metaboolseid ahelaid, mida ta ise ei toeta - näiteks vitamiinide ja nende prekursorite süntees, teatud toksiinide lagunemine, tselluloosi lagunemine seeditavateks polüsahhariidideks (mäletsejalisteks jne) jne.

Jeffrey Gordoni (Washingtoni Ülikool, St. Louis, Missouri) meditsiinikoolis laboratooriumis läbi viidud uuringud võimaldasid seostada seedetrakti bakterite liikide mitmekesisust inimese tervisliku toitumise ja metaboolsete omadustega. Katse tulemused avaldati 2006. aasta detsembri looduse numbris. Üheaastase eksperimendi käigus tehti ettepanek luua seos inimeste ülekaalulisuse ja soolestiku mikroobide populatsiooni koostise vahel. Kümme rasvat inimest, kes nõustusid oma kõhupiirkonnad teadusliku altariga kokku panema, olid jagatud kahte rühma. Üks käis madala rasvasisaldusega toidus, teine ​​madala rasvasisaldusega dieet. Kõik vabatahtlikud kaotasid kaalu ja samal ajal muutsid nad kahe soolestiku mikroorganismide rühma suhet: Firmicute'i rakkude arv vähenes ja vastupidi kasvanud bakteriteede arv. Madala rasvasisaldusega toitumise korral sai selline muutus hiljem märkamatuks - pärast seda, kui patsiendid kaotasid 6% oma kehakaalust ja madala süsivesikutega dieediga - pärast esimese kilogrammi kaotamist (2% nende esmasest kehamassist). Samal ajal oli mikrofloora koostise muutus veelgi tugevam, seda vähem osaleti eksperimendis.

Paralleelselt tehti samas laboris eksperimente laboripatsidel, kellel oli leptiini geeni mutatsioon, "rasvkoe hormoon" - valk, mis sünteesitakse rasvkoe rakkudes ja aitab kaasa küllastumishäire moodustumisele. Hiirtel, kes on kahjustanud selle geeni mõlemat eksemplari (see mutatsioon on näidatud Lep obindeksiga), sööb seda 70% rohkem kui metsikut tüüpi koos kõigi sellest tulenevate tagajärgedega. Firmicute sisu soolestikus on poolteist korda suurem heterosügootsete joonte sisaldusest, kus on ainult üks defektne alleel (ob / +) ja metsiktüüpi joonte normaalse geeni homosügootne (+ / +).

Mikrofloora mõju tema "omaniku" ainevahetusele uurijad uurisid teises mudelis - gnotobioticheskimi hiirtel.

Biomeditsiinilistes uuringutes ei kasutata tihti selliseid loomi, kes sünnihetkel elavad steriilsetes kambrites ja ei ole kunagi kohanud ühtegi mikroobit oma elus. Lihaskude, küülikute ja eriti kitsekarja absoluutne steriilsus on kallis ja tülikas ning pärast kohtumist esimese mikroobiga või viirusega surevad elusolendid surma või muutuvad sobimatuks edasisteks katseteks. Mis juhtub gnotobiotovil immuunsüsteemiga, on eraldi loend, ja nad söövad kolme ja samal ajal - naha ja luude tõttu, kuna neil puudub mikroorganismide seedetrakt.

Pärast rasvunud (ob / ob) doonorite mikrofloora siirdamist kahandati kahe nädala jooksul gnatobiot-hiir peaaegu poolteist korda (47%). Need, kes metsiktüüpi (+ / +) normaalse kaaluga doonoritega mikrofloora külvatakse, leiti ainult 27%.

Sümbootilise hiire-mikroobse organismi muutuste edasise uurimise tulemused tõestasid suurepäraselt hüpoteesi, et rasvunud inimeste mikrobioos aitab kaasa toidu sügavamale töötlemisele. Rasvunud ja normaalsete hiirte väljaheites DNA proovide võrdlus on näidanud, et ülekaalulisuse mikrobiumid on küllastunud ensüümi geenidega, mis võimaldavad polüsahhariidide tõhusamat degradatsiooni. Rasvahiirte soolestikus sisaldus suures koguses fermenteeritavaid lõppsaadusi - äädikhappe ja võihapet sisaldavaid ühendeid, mis osutab toidukomponentide sügavamale töötlemisele. Kalorimeetriline (alates sõna "kaloreid"!) Analüüsid väljaheiteproovide kohta kinnitasid seda: ob / ob hiirte väljaheide sisaldas vähem kaloreid kui metsiktüüpi hiirtel, kes ei absorbeerisid täielikult toitu.

Lisaks oluline informatsioon "idu" komponent rasvumine, autorid suutsid näidata põhimõtteliselt sarnased mikrofloora rasvunud inimeste ja hiired, mis avab uued perspektiivid uuring probleemi ülekaalust, ja võib-olla - ja seda probleemi lahendada, "üleandmine" terve mikrofloora või selle kujunemise patsientidel rasvunud.

Asjaolu, et mikrobiota saab kontrollida peremehe metabolismi, ei ole enam kahtlust. Gordoni uurimus ülekaalulise aine kohta on võimaldanud silda ainevahetushaiguste raviks, nagu üldine ammendumine, mis mõjutab lapsi ühe kuni nelja aastaga väikestes riikides, kus on troopiline kliima - marasmus (see sõna on ainult lingvistiline seos marasmusega: kreeka marasmoos sõna-sõnalt tähendab ammendumist, väljasuremist) ja kwashiorkor (ühe Ghana suguharu keele kwashiorkor - punane poiss keeles). Haiguste esinemine on seotud proteiinide ja vitamiinide puudumisega rinnaga toitmise ajal täiskasvanutele. Kuid haigus mõjutab selektiivselt lapsi, kelle vennad ja õed ei kogenud mingeid probleeme piirkonna traditsioonilise toiduga üleminekuga. Uuringud on näidanud, et haigete laste soole mikrofloor on väga erinev vanemate mikrofloora ja tervislike vendade ja õdede mikrofloora. Esiteks märgiti, et Bacteroidetes soolestiku populatsioonis on peaaegu täielik puudumine ja proteobakterite ja fusobakterite tüüpide hulka kuuluvate haruldaste liikide domineerimine. Pärast haigeid lapsi (hoolikalt, et mitte üleannustamist!) Tois intensiivselt proteiinisisaldusega toitu, muutus nende mikrobiota sarnaseks normaalseks, näiteks sugulastele, mille domineerimine oli Bacteroidetes ja Firmicutes.

Hiljutised uuringud ei ole mitte ainult põhjalikult muutnud praegust arusaama inimese soole mikrofloorast, vaid aitasid kaasa ka sellise kontseptsiooni tekkimisele, mis käsitleb soolestiku mikrobituatsiooni kui inimkeha täiendavat paljukellaarne "organ". Org, mis koosneb erinevatest rakuliinidest, mis on võimelised suhtlema nii enda kui ka peremeesorganismi omadega. Instituut, mis jagab energia voogu, täidab olulisi füsioloogilisi reaktsioone, muutub keskkonna mõju all ja muutub eneseregreerumiseks, kui muutused on tingitud välistingimustest.

Jätkub teadus "bakteriaalne keha" saab ja tuleb viia seaduste mõistmist selle toimimise avalikustamise tema õrn suhteid vastuvõtva ja sellest tulenevalt uute võitlemise meetodid inimese haiguste suunatud häirete raviks nii metaorganizma komponente.

Valery Poroiko, Ph.D.
Chicago Ülikool, üldkirurgia osakond
Portaal "Eternal Youth" www.vechnayamolodost.ru

Populaarses mehaanikas nr 4-2008 avaldatud artikli ajakirja versioon

Bakterite liigi identifitseerimine, sekveneerides ribosomaalse RNA 16S geeni, meetodi roll ja koht bakteriaalsete infektsioonide diagnoosimisel. Lõpetatud: Saveliev. - esitlus

Ettekanne ilmus 4 aastat tagasi Ludmila Shumikhina poolt

Seotud esitlused

11. klassi tutvustamine teemal: "Bakterite liikide identifitseerimine, sekveneerides ribosomaalse RNA 16S geeni, meetodi roll ja koht bakteriaalsete infektsioonide diagnoosimisel. Lõpetatud: Saveliev." Laadige alla tasuta ja ilma registreerimiseta. - ärakiri:

1 Bakterite liikide identifitseerimine ribosomaalse RNA 16S geeni sekveneerimisega, meetodi roll ja koht bakteriaalsete infektsioonide diagnoosimisel : Cand. biol. Afonyushkin Vasili Nikolajevitš PhD biol. Afonyushkin Vasili Nikolajevitš

2 Eesmärgid: 1. osata DNA elektroforeesi agaroosgeelil 2. õppima meetod analüüs sekveneerimise tulemused ning teostama ehituse nukleotiidijärjestused, geenifragmendid 16 S ribosomaalse RNA isolaatide saadud master Bacillus perekonna 1. DNA elektroforeesi agaroosgeelil 2. tundmaõppimiseks analüüsimeetod sekveneerimise tulemused ja viia läbi perekonna Bacillus 3 isoleeritud ribosoomi RNA 16S geeni fragmentide nukleotiidjärjestuste konstrueerimine. Uurige väljavaated sekveneerimismeetodite ja biokeemia ühiseks kasutamiseks cal identifitseerimine bakterid 3. Uurida väljavaated jagada sekveneerimismeetoditel ja biokeemiline identifitseerimine bakterid Eesmärk: uurida võimalusi meetodi konkreetsete identifitseerimine bakterid sekveneerimise 16S ribosoomi RNA koos traditsiooniliste identifitseerimine

3 Materjalid ja meetodid puhaste kultuuridega isolaadid kanti MPA tundi ja pärast inkubatsiooni baktersuspensiooniga valmistati fosfaatpuhverdatud soolalahuses. Kultuurid värviti grammiga ja mikroskoopiliselt. Hinnati järgmise biokeemilised omadused: käsutamine tsitraat, malonaat, glükoos, laktoos, mannitool, sahharoos, inositool, sorbitool, arabinoos, maltoos, fenüülalaniin, moodustumise indool, vesiniksulfiidi, atsetilmetilkarabinola (Reaction Foges- Proskauer), juuresolekul beetagalactosidaas, karbamaasi, arginiini Dekarboksülaasi ja lüsiin, arginiini hüdrolaas. Kultuurid testiti katalaas, tsütokroomoksüdaasi aktiivsus, moodustumise nitritid, pigmendi sünteesi, antibiootikumiresistentsuse ja uurisid kultuuri ja morfoloogilised omadused. Beetagalactosidaas ja tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktiivsust testiti keskmise Uriselekt 4 (BioRad) DNA eraldati fenolhloroformennym eesmärgiga määrata, põhinedes sekveneerimine 16S ribosomaalse geeni RNAi fragment geenidevaheliste vahetükki ribosomaalse RNA ja 16-23S hulga biokeemilisi, kultuuri- ja morfoloogilised tunnused.

4 Kultuurilised omadused: kasvukultuurid ei kasvas Endo keskkonnas, st ei puuduta enterobakterite kasvatati liha peptooni agar aeroobsetes tingimustes 37 ° C värvumisomadustega: kultuuri kasvatati uuritakse mikroskoopiliselt ja Gram-värvimisega, mis võimaldas kindlaks teha, et saadud kultuur on spooride Gy + kleepub omaduste Kultuurid

Uuring disain: DNA eraldati kasvukultuuridest ja PCR viidi läbi universaalsete praimeritega, mille tulemusena amplifitseeriti ribosomaalse RNA 16S geeni fragmenti

6 Praimeriga lahust jagatakse 4 katseklaasis, millest igaüks sisaldab 4 deoksünukleotiidi dATP, dTid, dTPP (üks neist on märgistatud radioaktiivse isotoobiga) ja üks neljast 2; see aktiveeritakse kasvav ahela segu kõigis asendites ja pärast selle kinnitumist peatub ahela kasv viivitamatult. Selle tulemusena moodustatakse neljas tuubis, kus osaleb DNA polümeraas, erineva pikkusega oligonukleotiidide komplekt, kaasa arvatud praimerjärjestus. Järgnevalt lisatakse kanüülide jaoks formaati, mis erineb ketidest, ja elektroforeesi polüakrülaadi geel viiakse läbi neljal rajal. Sellega viiakse läbi raadioautograafia, mis võimaldab teil "lugeda" sekveneeritud DNA sektsiooni nukleiinjärjestust. Biokeemias ja molekulaarbioloogias kasutatakse valkude makromolekule ja nukleiinhappeid (ja nende fragmente) eraldi eraldamiseks elektroforeesi. Seda meetodit on palju erinevaid. See meetod leiab laialdast kasutamist eraldamiseks segudest biomolekulide fraktsioonideks või üksikuid aineid ning kasutatakse biokeemia, molekulaarbioloogia, kliinilise diagnostika, populatsiooni bioloogia (õppimine geneetilise variatsiooni) ja dr.belkovnukleinovyh happed Elektroforees käesoleva elektrokineetilised nähtus nihkumise hajutatud olekus (kolloidi või valgu lahused) vedelas või gaasilises keskkonnas välise elektrivälja mõjul. Elektrivälja elektrokoreetiline nähtus Elektroforees Uuring disain: PCR tooted eraldati agaroosgeel-elektroforeesiga. Sangeri meetod

7 Meie enda uuringu tulemused Fig.1 Ribosomaalse RNA 16S geeni fragmendi kapillaarse elektroforeesi tulemused

8 Joonis 2 fülogeneetiline puu, mis on konstrueeritud ribosomaalse RNA 16S geeni fragmendi viimistulemise tulemuste alusel

9 Oma uurimistulemused. 3 nukleotiidjärjestuse võrdluse tulemused

10 tulemust biokeemiliste uuringute kultuuride lehe test PBDE biokeemilised omadused tüve B.licheniformis: negatiivne kasutamise tsitraat, malonaat negatiivne, naatriumtsitraat + glükoos negatiivse negatiivse lüsiini, arginiini negatiivne, negatiivne ornitiin, fenüülalaniin negatiivne, indool negatiivsed karbamiidpositiivsed atsetilmetilkarabinol negatiivselt sulfiidi negatiivne, glükoosipotentsiaal, b-galaktosidaasi positiivne, laktoosne negatiivne, beckons positiivne, sahharoos positiivne, inositool positiivne oh sorbitool on positiivne, maltoos on positiivne

11 Kokkuvõte Sekveneerimise aluseks olevate mikroorganismide spetsiifiline identifitseerimine võib olla laboratoorse diagnostika "kullastandard", kuid meetodi täpsust piirab GenBanki andmebaaside täpsus ja täielikkus ning seepärast on vaja kinnitavate testide täiendavat kasutamist.

16s rna analüüs

Biotehnoloogia, 2005, №6, p. 3-11

Kavandatakse meetodit mikroorganismide identifitseerimiseks 16S RNA geeni PCR produktist koosnevate restriktaasfragmentide (PDFR) pikkuse polümorfismi pikkuse analüüsil, mille pikkus on 1500 nukleotiidi. Valiti 6 restriktsiooni endonukleaasi komplekt (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ja RsaI), mis võimaldab PCGF-i kasutades kasutada paljusid mikroorganisme.
Merevee looduslikest isolaatidest eraldati neli isoleeritud termolabiilseid aluselisi fosfataasi. Nende tüvede PDFR-i analüüs, võrreldes erinevate mikroorganismide 16S RNA geenide kohta arvutatud tulemustega, võimaldas tuvastada, et tuvastatud tootjad kuuluvad perekonda Alteromonas.

Koos tavapäraste mikroorganismide tuvastamise meetoditega, mis kasutavad kultuurilisi ja morfoloogilisi omadusi, samuti keemilisi ja biokeemilisi reaktsioone [1], mikroorganismide määramise meetodid, mis põhinevad mikroorganismide erinevate geenide nukleotiidijärjestustel [2-4] ja üksikute bakteriaalsete geenide amplifitseerimise tulemusel saadud DNA restriktsioonifragmentide pikkuste polümorfismide analüüs [5, 6]. Geenid, mis kodeerivad 16S ja 23S ribosomaalset RNA-d, on identifitseerimiseks kõige sobivamad, kuna need esinevad kõigis bakterirakkudes ja on enamiku mikroorganismide jaoks perekondlikud [7-9]. Mikroorganismide lähedalt seotud liikide ja alamliikide tuvastamiseks võib kasutada 16S ja 23S RNA geene sisaldavat DNA-fragmenti ja nendevahelist speisserit, mis on muutlikum.

See dokument esitab mitmesuguste mikroorganismide kohta 1500 nukleotiidi pikkusega PCR-i FDPR-analüüsi tulemused ning näidati, et 6 restriktsiooni endonukleaasi Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ja RsaI kasutamine võimaldab enamikku mikroorganisme usaldusväärselt tuvastada. Selles töös identifitseeriti 4 uut termolabiilse aluselise fosfataasi tootjat ja pakuti välja pakutud meetodi abil, viidi läbi nende PDPD võrdlev analüüs mikroorganismide tuvastamiseks. Võrdluse põhjal jõuti järeldusele, et leitud tootjad kuuluvad perekonda Alteromonas.

EKSPERIMENTINGIMUSED

Termolabiilse aluselise fosfataasi tootjate tuvastamiseks viidi 50 μl merevee toitaine agaripinnale ja analüüsiti vastavalt kirjeldusele [11]. Mikroorganismide biomassi tootmine toimus, kasvatasid tootjad 20 ° C juures puljongis, mis sisaldas 1% trüptooni (AGS GmbH, Saksamaa), 0,5% pärmiekstrakti (sama ettevõte) ja soolavett (NaCl - 27,5, MgCl2 - 5, MgSO4 - 2, CaCI2 - 0,5, KCl-1, FeSO4 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2-7,7. Seemne puljong jaotati 200 ml 700 ml kiiktoolist kolvidesse ja loksutati kiirusel 150 p / min 16 tundi.

Kromosomaalse DNA eraldamine teostati vastavalt meetodile [13].

Ribosoomi RNA 16S geeni amplifitseerimine viidi läbi, kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni, nagu on kirjeldatud artiklis [14].

Amplifitseeritud DNA restriktsioonireaktsioon viidi läbi 4 tundi temperatuuril 37 ° C 20 ui reaktsioonisegus, mis sisaldas 2 ühikut. tegutsema liik Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI või RsaI MTÜ "SibEnzyme", sobivas puhvris. Reaktsioon peatati, lisades 5 ui stopperahust, mis sisaldas 0,1 M EDTA, 0,05% bromofenoolsinist ja 40% sahharoosi.

Piiratud amplifitseeritud DNA produktide elektroforeetiline eraldamine teostati 2% agaroosiga (Sigma) triisatsetaatpuhvris koos etiidiumbromiidiga (0,5 mg / l) 120 V juures 4 tundi.

DNA fragmentide pikkuse määramiseks kasutati DNA molekulmassi markereid (100 pp +1,5 Kb DNA markerid, NPO SibEnzyme). Saadud piirangute kindlaksmääramine teostati Gel Pro Analyzeri versiooniga 4.0.00.001. Iga fragmendipikkuse identsuse protsent arvutati iga mikroorganismide paari kohta, võrdledes iga restriktsiooniensüümi jaoks eraldi restriktsioonimustreid eraldi. Piiratud pikkuste võrdlemisel peeti DNA fragmente identseks, mille pikkus ei erinenud rohkem kui 5%.

Katsete andmete võrdlemiseks avaldatud 16S RNA geenijärjestustega kasutati järjestatud järjestuste geneetilist andmepanka.

TULEMUSED JA ARUTELUD

Merevee looduslikest isolaatidest eraldasime Alteromonas undina traditsioonilisel meetodil neli tüve, mis tähistavad termostabiilse fosfataasi nimetust 20, 27, 48 ja varem kirjeldatud tüve [11]. Mikroskoopiliste mikroorganismide biomassist saadud liinide identifitseerimiseks vedela toidulisandiga, millele lisati meresoolasid, eraldati kromosomaalne DNA.
Järgnevalt kasutati polümeraasi ahelreaktsioonis kromosoomi DNA-d, et amplifitseerida ribosomaalse RNA 16S geeni. Amplifitseerivat produkti töödeldi sõltumatult 6 erineva restriktsiooni endonukleaasiga. Kõik meie kasutatavad kitsendused on tetranukleotiidi äratundmissaidid, mis võimaldab saada amplifikatsiooniprodukti lõhestamise tulemusena 3 kuni 8 DNA fragmenti, mis on umbes 1500 nukleotiidi pikk. Kasutatavatel Sse9I ja Tru9I restriktsiooniensüümidel on vastavalt AATT ja TTAA tuvastamise saidid, samas kui BsuRI ja MspI restriktsiooniensüümid lõigatakse GGCC ja CCGG saitide kaudu. Restriktsioonisaidid BstMBI ja RsaI, vastavalt GATC ja GTAC, sisaldavad kõiki nelja nukleotiidi. Meie arvates peaks selline restriktsiooni endonukleaaside valik tagama universaalsuse nii AT-rikka ja GC-rikas genoomidega mikroorganismide tuvastamisel. Kvantitatiivselt arvestage, et täpselt 6 erineva restriktsiooni ensüümi kasutamine on optimaalne, kuna mitmete dokumentide [10, 15] kohaselt võib 1 või 3 piirata, ei pruugi polümorfismi tuvastada lähedalt seotud mikroorganismide tuvastamisel või vastupidi, põhjustada liiga suured erinevused ühe või mitme juhusliku mutatsiooni korral. Samas ei vii 10 erineva restriktsiooni endonukleaasi kasutamine DNA restriktsioonifragmendi pikkusega polümorfismi täiendavaks identifitseerimiseks ja on selgelt ülemäärane [9].
Joonisel 1 on kujutatud 16S geenide RNA piirangute arvutisimuleeritud mustreid, meie pakutud kuus restriktsiooniensüümi (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ja RsaI) pakutud komplekti. 16S RNA geenid võetakse järjestatud järjestuste geneetilisest pangast. Mikroorganismide valik oli üsna juhuslik. Kõik bakterid kuuluvad erinevatesse perekondadesse ja esindavad nii gram-negatiivseid kui grampositiivseid mikroorganisme. On näha, et kõigil mikroorganismidel on oma ainulaadne piirangute komplekt. DNA fragmentide arv varieerub vahemikus 23 kuni 30 (pikkusega fragmente vähem kui 100 aluspaari ei arvestata). Tabelis 1 on toodud erinevate fragmentide paaride jaoks DNA fragmentide pikkuste (identsete piirangute piirangud ei ületa 5%) arvutamise tulemused. See tabel näitab ainult osa võimalikest mikroorganismide paaridest, mida on kujutatud joonisel fig. 1. Kuid esitatud võrdlustulemused on üsna iseloomulikud ja võimaldavad meil näha, et DNA fragmentide pikkuse protsentuaalne identsus on tavaliselt erinevate mikroorganismide perekondade esindajatel 12-28%. Seega näitavad need andmed, et 16S RNA geenide restriktsioonimustriga koos meie poolt pakutavate restriktsiooniensüümide komplektiga võib olla alus bakterirakkude perekonna tuvastamiseks.

Joon. 1. 16S RNA geenide amplifikatsiooniproduktide elektroforeetilise eraldamise teoreetiliselt arvutatud struktuurid pärast restraasse Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) ja RsaI (6) töötlemist. Lood M - molekulmassi marker

16S RNA väärtus süsteemis. 16S RNA molekulaarne hübridisatsioon.

16S rRNA molekulaarne hübridisatsioon. Prokarüootsed ribosoomid koosnevad 3 allühikust, suured (23S), (5S) ja (16S). Gene 16S rRNA-il on fülogeneesi puhul olulised järgmised omadused:

1. RNA ribosoomid on universaalsed erinevatele liikidele, nagu ribosoomid ise. 2. 16S rRNA molekul on konservatiivne ja kõige vähem vastuvõtlik muutuste suhtes bioloogilise arengu käigus. 16S rRNA geeni muutus määra erinevates sümbiootilistes bakterites oli 2-4% nukleotiidi asendusest üle 60 Myr.3. 16S rRNA geenil on nii ülitundlikud kui ka varieeruvad piirkonnad (domeenid), mis võimaldab hinnata lähedaste ja lähedaste sugulussuhteid.4. Lisaks leiti, et rRNA cistrone ei ole seotud spetsiifiliste geneetiliste ülekandeprotsessidega.5. Geeni suurus (prokarüootides, see on umbes 1550-1640 bp pikkune) on statistiliste vigade vähendamise seisukohast optimaalne. Täielikku järjestust saab määrata ühe järjestuse abil, kasutades Sangeri meetodit. Nukleotiidikataloogide võrdlus. Seda meetodit kasutati 80. aastate alguses ja see oli bakterite süstemaatika ajaloolise tähtsusega. Samal ajal töödeldi RNA molekuliga (16S rRNA) ribonukleaasiga T, mis lõikab molekuli guaniini jääkideks. Saadud fragmentide suurus ei olnud suurem kui 20 nukleotiidi. Saadud oligonukleotiidid eraldati 2-mõõtmelise elektroforeesiga, sekveneeriti ja koostati kataloog, mis iseloomustas rRNA-molekuli spetsiifiliselt. Kataloogide võrdlemisel võeti arvesse fragmente pikkusega vähemalt 6 nukleotiidi. Kataloogide sarnasuse koefitsientide kohaldamisel loodi esmakordselt prokarüootide ühine fülogeneetiline puu. Riboprinting. Meetod põhineb rRNA geenide restriktsioonianalüüsil. Selleks eraldatakse rakust kogu DNA. Võetakse kaks praimerit, mis on homoloogsed 16S rRNA (väikese subühiku ss rDNA) geeni väga konserveeruvate külgnevate piirkondadega ja viiakse läbi PCR. Fragmendid töödeldakse mitu restriktsioonendonukleaa ja seedimist toodete iga endonukleaasidena eraldati agaroosgeelelektroforeesiga koos DNA suurusstandardit profiile. Fragmendi pikkuse polümorfism tuleneb asjaolust, et osa restriktsioonisaitidest kuulub geeni konservatiivsetele domeenidele ja mõned - muutuvaid domeene. Selles fragmentide osas on ühine kõikide valimis olevate liikide puhul. Ühiste ja erinevate fragmentide arvuga on võimalik arvutada liikide vaheline geneetiline kaugus. Application 12 restriktsiooniensüümiga äratundmissaiti 4 nukleotiidi pikkused võimaldab analüüsida cover 10-15% pikkusest 16S rRNA geeni ilma pöörduvad järjestamisega.

Kallis Microbe

Valery Poroiko
Ph.D., Chicago Ülikool, üldkirurgia osakond
Populaarne mehaanika 4. november 2008

Just sada aastat tagasi peeti inimese soolestikku elanud mikroobid parasiitideks ja kahjuriteks. Viimastel aastatel on inimese mikrobioota kutsutud oma keha organiks, mis on vajalik organismi normaalseks toimimiseks.

Kuna Pasteuri aeg on teada, on inimese seedetrakt sisuliselt voolu tüüpi bioreaktor, milles elutsevad paljud mikroorganismid. Selle aja jooksul on teadlaste suhtumine soole mikrofloorasse radikaalselt muutunud. Sada aastat tagasi oli Ilya Mechnikov, kaasaegse immuunsuse teooria asutaja, mille loomiseks ta sai Nobeli auhinna (kaks tema kaudselt vastasega, vähemalt sama suur Paul Ehrlich) pakkus isegi välja jämesoole eemaldamiseks üheks elundi pikendamise viisiks. Ja neile, kellele see meede tundus olevat liiga radikaalne, soovitasin ma nii palju keefiini kui võimalik, et suruda kahjulikke, tema arvates mikroobid kasulike piimhappebakteritega. Poolteist sajandit on kursus muutunud 180 kraadi võrra. Selgus, et normaalne soole mikrofloor, samuti nahk ja limaskestad, täidavad paljusid kasulikke funktsioone - näiteks pärsib kehas pidevalt ründavate patogeensete mikroorganismide elutähtsat toimet. Ja viimastel aastatel on mikrobioloogide kõige julgemad inimesed läinud veelgi kaugemale, kuulutades inimese ja tema mikroobide kui ühe sümbiootilise superorganismi.

Molekulaarbioloogia meetodite väljatöötamine tõi teadlased uuele tasemele arusaama inimese ja tema mikrofloora sümbioosi protsessidest, mis tundus hästi uuritud ja ei tundnud edaspidiseks uuringuks erilisi üllatusi. Kiire kasvu kiirus ja DNA sekveneerimismeetodite (selle nukleotiidide järjestuse määramine) kulude langus ning personaalarvutite võimsuse paralleelne kasv ja Interneti arendamine võimaldasid analüüsida teavet suurte genoomi piirkondade kohta. Pärast seda, kui sadu üksikute bakteriliikide kromosoome on detekteeritud, on mikroorganismide geneetikas muutunud uus lähenemine - populatsioonipõhine: analüüsitakse korraga kõigi teatud bakterite geene. Loomulikult osutus "inimese bioreaktori" populatsioon mikroobide populatsiooni uurimiseks kõige olulisemaks.

Esimene töö, mille tulemuseks oli täiesti uus nägemus soolestiku mikrobiotis, ilmus 1999. aastal Prantsuse Agronomisuuringute Instituudi (Prantsusmaa) ja Readingi Ülikooli (Suurbritannia) teadlaste rühma. Autorid otsustavad rakendada 16S RNA geenide sekveneerimise meetodit soole mikroobide populatsiooni uurimiseks (vt külgriba).

16S PHK - Bakteri ID

Esimene samm mikroorganismide kindlaksmääramisel on nende kasvatamine toitainekeskkonnas. Kuid mitmed mikroobid ei soovi kasvada ükskõik millises keskkonnas.

Kaasaegsed tehnikad
Uuring varem ligipääsmatud suitsetamine kultiveerumisvõimeliste bakterite ja hakkab kehtestada telli sootuks segane taksonoomia juba teada prokarüootne sai võimalikuks arengut bioinformaatikat ja tulek kaasaegseid tehnikaid molekulaarbioloogia - PCR võimaldab ühe DNA regiooni saada miljardeid kopeerivad, kloonimiseks valitud geeni bakteriaalsed plasmiidid ja sekveneerimise järjestusi metoodikad analüüsimiseks piisavas koguses saadud nukleotiidid. Ideaalne marker mikroorganismide identifitseerimiseks oli 16S ribosoomi RNA-d kodeeriv geen (ribosoomi igaüks kahest allüksusest - valkude sünteesi raku töötoad - koosnevad põimitud proteiini molekulidest ja ribonukleiinhapete ahelatest).

Täiuslik marker
See geen on kõigi tuntud bakterite ja arheede genoomis, kuid eukarüootides ja viirustes puuduvad ja kui olete leidnud selle iseloomuliku nukleotiidjärjestuse, tegelete kindlasti prokarüootide geenidega. Sellel geenil on nii konservatiivsed piirkonnad kui ka kõigi prokarüootide puhul ja liikide suhtes spetsiifilised. Konservatiivsed saidid serveerivad polümeraasi ahelreaktsiooni esimest etappi - katse DNA kinnitamine praimeritele (DNA seemnepiirkonnad, millega uuritud nukleotiidide ahel peab liituma, et alustada ülejäänud järjestuse analüüsimist) ja liigispetsiifilised - liikide määramiseks. Liikidepõhiste proovide sarnasuse aste peegeldab erinevate liikide evolutsioonilist sugulust. Kloonimiseks ja järgnevaks analüüsiks võite kasutada ribosomaalset RNA-d, mis on igas rakus suuremas koguses kui selle vastav geen. Kõik teadaolevate bakterite ja arheede 16S RNA nukleotiidijärjestused on laialdaselt kättesaadavad. Identifitseeritud järjestusi võrreldakse andmebaaside omadustega ja tuvastatakse bakteritüübid või deklareeritakse, et need kuuluvad harimata liikidele.

Uus taksonoomia
Viimasel ajal on intensiivselt läbi viidud vanade fenotüüpsete bakterite klassifikatsioon, mis põhineb halvasti vormistatud kriteeriumidel - alates kolooniate välimusest kuni toiduseelistuste ja värvimisvõime saavutamiseni erinevate värvainetega. Uus süstemaatika põhineb molekulaarkriteeriumidel (16S RNA) ja ainult osaliselt kordab fenotüübilist.

Mis meil on sees

16S RNA kodeerivad järjestused ekstraheeriti otseselt 125 mg inimese poolt "keskkonnast" polümeraasi ahelreaktsiooni abil (PCR), vabandust, väljaheide sisestati Escherichia coli plasmiididesse (mitte seetõttu, et see on soolestik, vaid seetõttu, et Escherichia coli on üks lemmik molekulaarbioloogide töökoorid) ja jälle isoleeriti paljundatud bakterite kultuurist. Seega moodustati kõigi proovi mikroorganismide 16S RNA geenide raamatukogu. Seejärel juhuslikult valiti ja sekveneeriti 284 klooni. Selgus, et ainult 24% saadud 16S RNA järjestustest kuulus varem tuntud mikroorganismidele. Rohkem kui sada aastat välistanud iga neljakümne viie mikrofloora iga inimese soolte eest klassikalise mikrobioloogiaga varustatud teadlaste tähelepanu! Teadlased lihtsalt ei suutnud leida tingimusi nende bakterite kasvatamiseks, sest kõige nördimatud soolestiku elanikud keeldusid traditsioonilisest mikrobioloogilisest keskkonnast kasvatama.

Täna, kasutades molekulaarseid meetodeid, on kindlaks tehtud, et kümnest 70 suurema bakteriaalse taksonist on täiskasvanu mikrobiotis esindatud. Umbes 90% meie mikroobidest kuuluvad Firmicute tüüpi (näiteks tuntud laktobakterid on piima souring peamised "süüdlased") ja Bacteroidetes on kohustuslikud anaeroobid (organismid, mis võivad elada üksnes hapniku puudumisel), mida sageli kasutatakse reostuse indikaatorina looduslikud veed kanalisatsioon. Ülejäänud 10% elanikkonnast jagunes taksonit Proteobacterite (need hõlmavad muu hulgas, E. coli), Aktinomütseedid (ühest liigist Actinomycetes antibiootikumi streptomütsiini eraldati), Fusobacteria (normaalsed elanikud suuõõne- ja põhjustavad sageli parodontiit), Verrucomicrobia (hiljuti leiti, et geotermiline allikas on nende mikroobide vorm, mis toidab metaani, mis on teiste mikroorganismide elulise aktiivsuse tõttu soolestikus), tsüanobaktereid (siiani nimetatakse neid endiselt sageli sinine-vetikateks), Spiroheteid (õnneks nd, mitte kahvatu), Synergistes ja VadinBE97 (millist loomad, küsi loojad uue taksonoomia prokarüootides).

Mikroobide meis on rohkem kui inimene

Sel eesmärgil kasutatakse kõige automatiseeritumaid, arvutispetsiifilisi ja suure jõudlusega DNA sekveneerimise tehnoloogiaid, mis võimaldavad analüüsida lühikesi nukleotiidjärjestusi, kokku panna mõnda vastavat tähte nende sektsioonide otstes, korrata korduvalt seda protseduuri iga genoomi tüki jaoks ja saada üksikute geenide ja kromosoomide dekodeerimine kiirusel kuni 14 miljonit nukleotiidi tunnis - suurusjärgus kiiremini kui mõni aasta tagasi. Nii leiti, et soolestiku mikrobiotis on umbes 100 triljonit bakteriraku - umbes kümme korda rohkem kui inimkeha rakkude koguarv.

Bakteriaalse metagenoomi moodustavate geenide komplekt on umbes sada korda suurem kui inimese keha geenide komplekt. Kui me räägime mikroobide populatsioonis toimuvate biokeemiliste reaktsioonide mahust, on see jälle korduvalt suurem kui inimkeha biokeemiliste reaktsioonide maht.

Bakteriaalne "reaktor" rakendab peremeesorganismi metaboolseid ahelaid, mida ta ise ei toeta - näiteks vitamiinide ja nende prekursorite süntees, teatud toksiinide lagunemine, tselluloosi lagunemine seeditavateks polüsahhariidideks (mäletsejalisteks jne) jne.

Alates lapsepõlvest vanaduseni

Hoolimata asjaolust, et soole mikroorganismide liigiline koosseis on üsna monotoonne, võib erinevate inimeste erinevate mikroobiootiliste süstemaatiliste rühmade esindajate kvantitatiivne suhe olla väga erinev. Kuid mis on normaalne soole mikrofloor ja millised on selle moodustamise viisid?

Sellele küsimusele vastasid Stanfordi ülikooli Patrick Browni juhitud Ameerika bioloogide rühma 2007. aasta töö. Nad jälgisid mikroobioti moodustumist 14 vastsündinud beebil esimesel eluaastal. Autorid suutsid luua mitmeid seedetrakti koloniseerimise allikaid. Imiku mikrobiootil oli sarnane ema mikroflooraga: rinnapiima proovide vaginaalne, väljaheide või mikrofloora. Sõltuvalt koloniseerumisallikatest esines esimese eluaasta jooksul imikute soole mikroflooras eri liike. Need erinevused olid kogu uurimisperioodi jooksul olulised, kuid üheaastase vanuse järgi sai täheldatud täiskasvanud mikrobiota moodustumine. Huvitavad andmed saadi kaksikutega. Nendes sisalduv mikrofloor oli kompositsioonist peaaegu identne ja sama ka sama. See avastus näitas mikrobiota peremehepaari inimese komponendi tohutut rolli soolestiku mikrofloora populatsiooni moodustamisel. Katse puhtuse tõttu oleks loomulikult vaja eraldada lapsed veel haiglasse (muide India filmi imeline lugu! Aastate jooksul tutvuvad kaksikud mikrofloora analüüsidega üksteist). Kuid teiste uuringute andmed kinnitasid eeldust, et inimese biokeemia individuaalsed, kaasa arvatud pärilikud omadused avaldavad suurt mõju mikroobiootilise koostise suhtes.

Õhuke ja paks

Jeffrey Gordoni (Washingtoni Ülikool, St. Louis, Missouri) meditsiinikoolis laboratooriumis läbi viidud uuringud võimaldasid seostada seedetrakti bakterite liigilise mitmekesisusega inimese dieedi ja metaboolsete omadustega. Katse tulemused avaldati 2006. aasta detsembri ajakirjas Nature. Üheaastase eksperimendi käigus tehti ettepanek luua seos inimeste ülekaalulisuse ja soolestiku mikroobide populatsiooni koostise vahel. Kümme rasvat inimest, kes nõustusid oma kõhupiirkonnad teadusliku altariga kokku panema, olid jagatud kahte rühma. Üks käis madala rasvasisaldusega toidus, teine ​​madala rasvasisaldusega dieet. Kõik vabatahtlikud kaotasid kaalu ja samal ajal muutsid nad kahe soolestiku mikroorganismide rühma suhet: Firmicute'i rakkude arv vähenes ja vastupidi kasvanud bakteriteede arv. Madala rasvasisaldusega toitumise korral sai selline muutus hiljem märkamatuks - pärast seda, kui patsiendid kaotasid 6% oma kehakaalust ja madala süsivesikutega dieediga - pärast esimese kilogrammi kaotamist (2% nende esmasest kehamassist). Samal ajal oli mikrofloora koostise muutus veelgi tugevam, seda vähem osaleti eksperimendis.

Rasvumise vastu võitlemine

Teadlaste edasise uuringu tulemused sümbiootilise hiire-mikroobse organismi muutuste kohta (vt lahter "Katsed hiirel") kinnitasid suurepäraselt hüpoteesi, et rasvunud inimeste mikrobioos aitab kaasa toidu sügavamale töötlemisele. Rasvunud ja normaalsete hiirte väljaheites DNA proovide võrdlus on näidanud, et ülekaalulisuse mikrobiumid on küllastunud ensüümi geenidega, mis võimaldavad polüsahhariidide tõhusamat degradatsiooni. Rasvahiirte soolestikus sisaldus suures koguses fermenteeritavaid lõppsaadusi - äädikhappe ja võihapet sisaldavaid ühendeid, mis osutab toidukomponentide sügavamale töötlemisele. Kalorimeetriline (sõna "kaloreid"!) Hiiri väljaheite proovide analüüs kinnitas seda: ob / ob hiirte väljaheide sisaldas vähem kaloreid kui metsiktüüpi hiirtel, kes ei absorbeerisid täielikult toitu.

Lisaks oluline informatsioon "idu" osa ülekaalulisuse autorid suutsid näidata põhimõtteliselt sarnased mikrofloora rasvunud inimeste ja hiired, mis avab uued perspektiivid uuring probleemi ülekaalust ja võimalik seda probleemi lahendada, "üleandmine" terve mikrofloora või selle kujunemise patsientidel rasvunud.

Katsetatud hiirtele

Ja väsimusega

Asjaolu, et mikrobiota saab kontrollida peremehe metabolismi, ei ole enam kahtlust. Uurimislabor Gordon, kes oli pühendunud ülekaalulisuse probleemile, lubas silda metaboolsete haiguste raviks. Nende hulgas on liiki üldine kurnatus, mis mõjutavad lapsi ühest aastast nelja aasta halvas troopilistes maades nagu marazmus (kuni idiootsus, et sõnal on ainult keeleliselt :. Kreeka marasmoz tähendab sõna-sõnalt ammendumine, väljasuremine) ja kwashiorkor (keeles üks hõimud Ghana kwashiorkor - "punane poiss"). Haiguste esinemine on seotud proteiinide ja vitamiinide puudumisega rinnaga toitmise ajal täiskasvanutele. Kuid haigused mõjutavad selektiivselt lapsi, kelle vennad ja õed ei kogenud mingeid probleeme piirkonna traditsioonilise toiduga üleminekuga. Uuringud on näidanud, et haigete laste soole mikrofloor on väga erinev vanemate mikrofloora ja tervislike vendade ja õdede mikrofloora. Esiteks märgiti, et Bacteroidetes soolestiku populatsioonis on peaaegu täielik puudumine ja proteobakterite ja fusobakterite tüüpide hulka kuuluvate haruldaste liikide domineerimine. Pärast haigeid lapsi (hoolikalt, et mitte üleannustamist!) Toidetud intensiivselt valgusisaldusega toitu, tundus nende mikrobiota nagu tavaline, näiteks sugulastel, Bactrotete ja Firmicute levimusega.

Hiljutised uuringud ei ole mitte ainult põhjalikult muutnud praegust inimese soole mikrofloora arusaamist, vaid aitasid kaasa ka kontseptsiooni tekkimisele, mis arvestab soolestiku mikrobiooto kui täiendava mitmekokeelse inimorgani. Org, mis koosneb erinevatest rakuliinidest, mis on võimelised suhtlema nii enda kui ka peremeesorganismi omadega. Instituut, mis jagab energia voogu, täidab olulisi füsioloogilisi reaktsioone, muutub keskkonna mõju all ja muutub eneseregreerumiseks, kui muutused on tingitud välistingimustest. Jätkub teadus "bakteriaalne keha" saab ja tuleb viia seaduste mõistmist selle toimimise avalikustamise tema õrn suhteid vastuvõtva ja sellest tulenevalt uute võitlemise meetodid inimese haiguste suunatud häirete raviks kaks komponenti metaorganizma.

16s rna analüüs

Ribosoomsed ribonukleiinhapped (rRNA) on mitmed RNA molekulid, mis moodustavad ribosoomi aluse. RRNA peamine ülesanne on teostada tõlkimisprotsess - tRNA adaptermolekulide abil mRNA andmeid lugeda ja tRNA külge kinnitatud aminohapete peptiidsidemete moodustumist katalüüsida.

Sisu

Ribosoomi alarakendid ja rRNA nomenklatuur

Intaktsete ribosoomide elektronmikroskoopilisel kujul on märgatav, et need koosnevad kahest erineva suurusega osakestest.

Osakeste masside suhe on

2: 1; mass omakorda väljendatakse konstandid mõõta otse settimine (lahendades määr Svedberg ühikut, S) temperatuuril ultratsentrifugovanii ning seda oli see parameeter aluseks nomenklatuuri rRNA ja ribosoomid ja ribosoomi allüksuste: tüüp kasutatavate nimetuste

Näiteks 16S-rRNA-ga tähistatud prokarüootide ribosomaalne RNA, mille setetetegur on 16 Svedbergi ühikut.

Kuna sedimentatsioonikoefitsiendid ei sõltu mitte ainult molekulmassist, vaid ka osakeste kujust, siis segunemise koefitsiendid dissotsiatsiooni ajal on mittesisaldavad: näiteks on bakteriaalsed ribosoomid molekulmassiga

3 * 10 6 Daltoni settimiskoefitsient on 70S, tähistatud kui 70S ja desotsieerub allühikutesse 50S ja 30S:

Iga riboosomaalne alaühik sisaldab ühte pika pikkusega rRNA molekuli, mille mass on

1/2 - 2/3 ribosoomi poolkuuli massist, seega bakteri 70S ribosoomide puhul 50S subühik sisaldab 23S rRNA-d (pikkus

3000 nukleotiidi) ja 30S subühik sisaldab 16S rRNA-d (pikkus

1500 nukleotiidi); suurte ribosomaalse subühiku välja arvatud "pikk" rRNA sisaldab ka ühte või kahte "lühike" rRNA (5S rRNA bakteriaalsete 50S ribosoomi allüksuste või 5S ja 5.8S rRNA bolshii eukarüootsete ribosoomi allüksuste).

Süntees

Ribosoomne RNA moodustab suure osa (kuni 80%) kogu rakulistest RNA-dest, selline rRNA kogus nõuab selle kodeerivate geenide intensiivset transkriptsiooni. Seda intensiivsust annab rRNA kodeerivate geenide suur hulk koopiaid: eukarüootides on mitusada (

200 pärmis) kuni kümnetesse tuhandetesse (erinevate puuviljade puhul 50-120 tuhat eksemplari) geenide kohta, mis olid organiseeritud tandemkordsete massiivides.

Inimestel seotakse rRNA-d kodeerivad geenid ka tandemkorduste rühmadesse, mis paiknevad kromosoomi lühikese käe keskosas 13, 14, 15, 21 ja 22.

Neid sünteesib RNA polümeraas I kui pre-ribosoomi RNA pikk molekul, mis lõigatakse eraldiseisvateks RNA-deks, mis moodustavad ribosoomi aluse. Bakterites ja arheaades sisaldab algne transkript tavaliselt 16S, 23S ja 5S rRNA-d, mille vahel eelregRRNA järjestused kustutatakse. Tavaliselt paikneb 16S ja 23S rRNA geenide vahel üks või mitu tRNA-geeni; Nii, E. coli-s on sellise geenigrupi esialgseks transkriptiks järgmine jada:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Selline transkript lõhustatakse ensüümi ribonukleaasi III fragmendid eel-rRNA ja tRNA-deks.

Eukarüootides transkribeeritakse 18S, 5.8S ja 25/28 rRNA koos RNA polümeraasiga I, samas kui 5S rRNA geen transkribeeritakse RNA polümeraasiga III.

Eukarüootides on rRNA kodeerivate geenide kontsentratsioonikohad rakkude tuumas tavaliselt hästi nähtavad, kuna need ümbritsevad ribosoomi subühikud kogunevad kohe kokku. Need klastrid on hästi värvitud tsütoloogiliste värvainetega ja on tuntud kui nukleosid. Niisiis on nukleotiidide esinemine iseloomulik mitte kõigile rakutsükli faasidele: propaaside raku jagamise ajal lahutatakse nukleos, kuna rRNA sünteesi taaskäivitamisel suspendeeritakse ja redutseeritakse rRNA süntees telofaasi lõpus.

Pro ja eukarüootse rRNA võrdlev analüüs

Prokarüootide ja eukarüootide ribosomaalsed RNA-d (nagu ribosoomid) erinevad üksteisest, kuigi need näitavad märkimisväärset sarnasust järjestuste piirkondade vahel. 70S prokarüootsed ribosoomid koosnevad suured 50S subühikust (ehitatud kahe rRNA molekuli 5S ja 23S alusel) ja väikese 30S subühikuga (ehitatud 16S rRNA alusel). 80S eukarüootne ribosoom koosneb suurest 60S subühikust (ehitatud kolme rRNA molekuli 5S, 5.8S ja 28S alusel) ja väikese 40S subühiku (ehitatud 18S rRNA alusel).

Järjestusteabe kasutamine

Teatud organismi rRNA-d kasutatakse meditsiinis ja evolutsioonibioloogias.

  • RRNA geen on üks konservatiivsemaid (vähem muutuvaid) geene. Seetõttu saab rRNA järjestuste sarnasuse ja erinevuste analüüsi põhjal määrata organismi süstemaatilise positsiooni ja lähedaste liikidega lahknemise aja.
  • rRNA on suunatud suure hulga antibiootikumid, millest mõned on kliinilises praktikas kasutatavate nii kasvu pärssimiseks baktereid (antibiootikumid, prokarüootne ribosoomi sidumise) kui ka inimeste haiguste raviks (antibiootikumid seostuda eukarüootne ribosoom). Esimene rühm sisaldab klooramfenikooli, erütromütsiini, kasugamütsiini, mikrokoksiini, spektinomütsiini, streptomütsiini, tiostreptoni. Teisele hügromütsiinile B, paromomütsiinile.

Seotud Artiklid Hepatiit